1 引物设计-手把手教你上手SnapGene

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• SebZ:有些有关PCR的具体实验操作视频里可能说的不太清楚，这里给大家补充整理一下： PCR具体反应的步骤： 解链 (denaturing)：一般98˚C左右，双链DNA打开变成单链 退火 (annealing)：温度降低，引物结合到模版上。由引物的退火结合温度决定（Tm） 延伸 (elongation)：DNA聚合酶开始从引物处的双链开始将剩下的单链补齐。由具体扩增的片段的长度决定（一般DNA聚合酶都是一定时间内合成议数量的片段） 循环，一般是30个周期左右 这些都可以在PCR仪 (thermocycler) 里具体设计程序，在实验室里可以接触到，这里很难用文字让大家直观的看到，所以就不多说了 引物设计的时候一定要注意是top strand还是bottom strand，因为这会决定之后PCR里DNA聚合酶扩增的方向。一般上游的引物是top strand, 下游的引物是bottom strand 一般20bp(碱基对)左右的引物会比较合适，有一些偏差也没有关系，但是最重要的是退火结合温度(Tm)。上游引物和下游引物的退火结合温度一定要一样（一般是50˚C~60˚C左右？）或者偏差比较小（一般5˚C以内可以接受），因为反应的时候只有一个退火结合温度。 可以根据需要，通过引物在要扩增的片段前后修改几个碱基。如果要在一个片段中间引入突变的话，可以把这个突变前面的部分扩增出来，尾端加上突变修饰；然后把这个突变后面的部分扩增出来，首端加上突变修饰，然后通过Gibson Assembly同源重组合并。 如果设计的两对引物中有一条有一个以上的结合位点，可以通过调整退火温度以及延伸时间来保证最后得到的片段是目标片段： 调整退火温度：一般有一个以上的结合位点的时候，除目标结合位点以外的其他的结合位点一般是错配（不完全互补配对），使得这些结合位点的退火温度会比目标位点的退火温度要低。如果差距比较大的话就不太会影响引物在退火的时候主要在目标结合位点配对结合。 调整延伸时间：有一条引物错配，导致出现多个可能的扩增片段时，如果非目标片段和目标片段的长度相差较大的时候，也是可以通过后续的电泳分离得到目标片段的。 但是总体来说，出现引物错配的话，反应的时候会浪费一部分引物扩增不需要的片段，因而还是尽量避免比较好。
• SebZ:要是大家都觉得可以的话我持续更新……？
• 家是最美的城堡:强烈要求UP主去掉背景音乐。。。emmmm.......讲解很好，就是听起来太困难了[撇嘴]
• 南肯某技工:bgm把up好听的声音盖住啦[笑哭]
• horsema123:音乐太吵了，没法安心听